La novena fase de la glucólisis implica la transformación del 2-fosfoglicerato en fosfoenolpiruvato (PEP) a través de un proceso de deshidratación llevado a cabo por la enzima enolasa:
El PEP destaca por su elevado potencial de transferencia de grupo fosforilo, superior al del 2-fosfoglicerato, debido a la presencia de un grupo enol-fosfato en vez de un simple éster fosfato. Este incremento en el potencial se comprende mejor al observar la siguiente reacción. Aldehídos y cetonas pueden existir en dos formas isoméricas; la forma enol, que presenta un doble enlace carbono-carbono junto a un grupo hidroxilo, y la forma ceto, más estable, que incluye un grupo carbonilo. La conversión entre estas dos formas, conocidas como tautómeros, se denomina tautomerización.
La tautomerización se ve limitada por la presencia del grupo fosfato, al igual que la estabilización por resonancia del ion fosfato libre. Por tanto, en esta etapa de la glucólisis, la transferencia de fosforilo al ADP se ve altamente favorecida, preparando el escenario para una eficiente síntesis de ATP en los pasos subsiguientes.